În procesul de realizare a studiilor genetice, întâlnim adesea mostre insuficiente de ARN, de exemplu, pentru studiul micilor tumori anatomice orale, chiar și probe unicelulare și mostre de mutații genetice specifice care sunt transcrise la niveluri foarte scăzute în celulele umane.Desigur, pentru testul COVID-19, dacă tampoanele nu sunt la locul potrivit sau nu sunt suficient de ori în timpul prelevării, dimensiunea eșantionului va fi foarte mică, motiv pentru care Comisia de Sănătate și Planificare Familială a ieșit acum două zile și a trecut testul, iar dacă prelevatorul de acid nucleic nu a luat șase probe, îl puteți raporta.
Sensibilitatea reactivului este importantă pentru că avem această problemă sau acea problemă, deci ce putem face pentru a îmbunătăți sensibilitatea RT-PCR?
Înainte de a discuta posibile soluții, să menționăm două mari complicații cu situația pe care tocmai am menționat-o.
În primul rând, ne facem griji cu privire la pierderea de ARN atunci când avem doar câteva populații de celule în eșantionul nostru.Dacă sunt utilizate metode tradiționale de separare și curățare, cum ar fi metoda coloanei sau metoda de precipitare cu acid nucleic, există o mare posibilitate ca cele câteva probe să se piardă.O soluție este să adăugați o moleculă purtătoare, cum ar fi ARNt, dar chiar și atunci, nu există nicio garanție că experimentul nostru de recuperare este OK.
Deci, care este o modalitate mai bună?O opțiune bună pentru celulele cultivate sau probele microanatomice este utilizarea lizei directe.
Ideea este să împărțiți celulele timp de 5 minute, să eliberați ARN-ul în soluție, apoi să opriți reacția timp de 2 minute, apoi să adăugați lizat direct în reacția de transcripție inversă, astfel încât să nu se piardă ARN-ul și, în final, să puneți ADNc-ul rezultat direct. în reacția în timp real.
Dar ce se întâmplă dacă, din cauza unui punct de plecare limitat sau a unei cantități mici de expresie a genei țintă, putem recicla tot ARN-ul și tot nu oferim suficiente șabloane pentru a obține un semnal bun în timp real?
În acest caz, etapa de pre-amplificare poate fi foarte utilă.
Următoarea este o schemă de creștere a sensibilității după transcrierea inversă.Înainte de a începe, trebuie să întrebăm în aval care ținte ne interesează, astfel încât să proiectăm primeri specifici pentru aceste ținte pentru pre-amplificare.
Acest lucru poate fi realizat prin crearea unui primer mixt cu până la 100 de perechi de primeri și un ciclu de reacție de 10 până la 14 ori.Prin urmare, este necesar un Master Mix special conceput pentru această cerință pentru a preamplifica cADN-ul obținut.
Motivul pentru stabilirea numărului de cicluri între 10 și 14 este că acest număr limitat de cicluri asigură aleatorie între diferitele ținte, ceea ce este crucial pentru cercetătorii care au nevoie de informații moleculare cantitative.
După pre-amplificare, putem obține o cantitate mare de ADNc, astfel încât sensibilitatea de detecție la back-end să fie mult îmbunătățită și putem chiar să diluăm proba și să efectuăm mai multe reacții PCR în timp real pentru a elimina eventualele erori aleatorii.
Ora postării: 11-apr-2023